Zeitschrift für Stammzellforschung und -therapie

Abstrakt

Strukturanalyse von dreidimensionalem menschlichen Nervengewebe aus induzierten pluripotenten Stammzellen

Patrick Terrence Brooks, Mikkel Aabech Rasmussen und Poul Hyttel

Ziel: Ziel der vorliegenden Studie war es, eine Methode zur Herstellung dreidimensionalen (3D) menschlichen Nervengewebes aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zu entwickeln und das Ergebnis durch eine Kombination aus Gewebe-Ultrastruktur und Expression neuronaler Marker zu analysieren.

Methoden: Ein zweistufiges Zellkulturverfahren wurde implementiert, indem menschliche iPSCs einem 3D-gerüstbasierten Protokoll zur neuronalen Differenzierung unterzogen wurden. Zunächst wurden neuronale Schicksals-induzierende kleine Moleküle verwendet, um eine neuroepitheliale Monoschicht zu erzeugen. Anschließend wurde die Monoschicht zu Einzelzellen trypsinisiert und in ein poröses Polystyrolgerüst eingepflanzt und weiter kultiviert, um ein 3D-Neuralgewebe zu erzeugen. Das Nervengewebe wurde durch eine Kombination aus Immunhistochemie und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) charakterisiert.

Ergebnisse: iPSCs entwickelten sich zu einem 3D-Neuralgewebe, das Marker für neurale Vorläuferzellen, frühe neurale Differenzierung und Reifung, radiale Gliazellen und zelluläre Proliferation exprimierte, darunter SOX2, Nestin, β-III-Tubulin, MAP2, Tau, BLBP und Ki67. Wir fanden eine Fülle von Rosettenstrukturen, die der Morphologie des sich entwickelnden Neuralrohrs ähnelten. Es zeigte sich, dass diese neuralrohrähnlichen Strukturen (NTLS) Bereiche der Erhaltung und Proliferation neuraler Vorläuferzellen enthielten . Die Ähnlichkeit mit dem embryonalen Neuralrohr wurde durch TEM-Analysen weiter untermauert, die luminale Tight Junctions und primäre Zilien zeigten. Darüber hinaus bestand das NTLS aus radialen, gliaähnlichen Zellen, die vom Lumen ausstrahlten, und neuralen Vorläuferzellen, die verlängerte Kerne aufwiesen, die eine Kerntransposition signalisierten, die bei der interkinetischen Kernmigration während der frühen Neurogenese zu beobachten war, und Mitosen.

Schlussfolgerung: Unsere Ergebnisse zeigten, dass dieses relativ einfache, auf 3D-Gerüsten basierende Protokoll zur neuronalen Differenzierung für menschliche iPSCs mehrere Schlüsselereignisse der frühen neuronalen Entwicklung nachbilden konnte. Die Organisation in NTLS und das Vorhandensein reifer Nervenzellen im diese Strukturen umgebenden Gewebe zeigten, dass dieses Protokoll Potenzial für In-vitro-Studien zur neuronalen Entwicklung und Krankheitsmodellierung hat.