Zeitschrift für Stammzellforschung und -therapie

Abstrakt

Quantifizierung megakaryozytischer Vorläuferzellen in Aphereseprodukten mittels Durchflusszytometrie und Echtzeit-PCR

Leinøe Eva, Nielsen Kaspar R, Baech John, Steffensen Rudi, Dybkaer Karen, Boegsted Martin und Johnsen Hans E

Hintergrund und Ziele: Die Qualitätsbewertung der autologen peripheren Blutstammzelltransplantation (PBSCT) kann durch die Zählung der megakaryozytischen CD34+/CD61+-Vorläuferzellen im Transplantat verbessert werden. Die Zählung der Untergruppen mittels Durchflusszytometrie (FC) war aufgrund der geringen Spezifität, die möglicherweise durch die Anhaftung von Thrombozyten oder Mikrokügelchen bedingt ist, schwierig zu standardisieren. Unser Ziel war es, die Anhaftung von Thrombozyten an hämatopoetische Stammzellen zu analysieren und einen quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionstest (RT-qPCR) für CD34- und CD61-Gentranskripte zu entwickeln. Die Analyse wurde verwendet, um CD34 und CD61 als Prädiktoren für eine späte Thrombozytenerholung nach PBSCT bei Non-Hodgkin-Lymphom (NHL) zu untersuchen. Material und Methoden: Die FC-Analyse wurde an Aphereseprodukten durchgeführt, die für die autologe Transplantation gewonnen wurden , und konfokale Mikroskopie wurde an sortierten Zellen angewendet. Die klinische Bewertung umfasste die Analyse der Leukaphereseprodukte von 21 aufeinanderfolgenden NHL-Patienten, die mit Hochdosistherapie und PBSCT behandelt wurden. Eine frühe Erholung wurde als eine beobachtete Thrombozytenzahl >20x10(9)/l vor Tag 12 nach der Transplantation und eine späte Erholung als eine beobachtete Thrombozytenzahl <20x10(9)/l nach Tag 12 nach der Transplantation definiert. Für die RT-qPCR-Analyse wurden CD34+-Zellen aus aufgetauten Leukaphereseprodukten sortiert, RNA extrahiert und zur weiteren Analyse der CD34- und CD61-mRNA-Spiegel mit TaqMan-Sonden in cDNA rücktranskribiert. Ergebnisse: Es zeigte sich, dass durch FC identifizierte CD34+/CD61+-Zellen eine spezifische Untergruppe ohne Anzeichen von anhaftenden reifen Thrombozyten bilden. CD34+/CD61+-Zellen exprimierten CD61-mRNA-Transkripte, die in komplementären CD34+/ CD61--Zellen nicht gefunden wurden. Es wurde keine positive Korrelation zwischen der auf FC basierenden Zählung und der RT-qPCR-Analyse der megakaryozytischen Vorläufer- Untergruppen festgestellt. Die Bewertung der klinischen Auswirkungen durch Vergleich von Proben von 21 Patienten mit früher und später Thrombozytenerholung ergab keine prädiktive Auswirkung von CD61/BACT (β-Actin), CD34/ BACT oder CD61/CD34 mRNA, Expressionsverhältnissen unter CD34+ sortierten Zellen. Schlussfolgerung und Perspektive: Eine spezifische Untergruppe von CD34+/CD61+ Zellen kann durch FC- und RTqPCR-Analyse identifiziert werden; die Zählung dieser Untergruppe korrelierte jedoch nicht mit der Thrombozytenerholung nach PBSCT. Zukünftige Studien zum prädiktiven Wert müssen in einer Gruppe von Patienten mit Transplantatversagen in internationaler Zusammenarbeit innerhalb der European Blood and Marrow Transplantation Group (EBMT) evaluiert werden.