Zeitschrift für Stammzellforschung und -therapie

Abstrakt

Reinigung unreifer Neuronen aus differenzierenden Nachkommen neuronaler Stammzellen mithilfe einer einfachen Schüttelmethode

Hassan Azari, Sharareh Sharififar, Roya P. Darioosh, Maryam Rahman, Jeff M. Fortin und Brent A. Reynolds

Ziel: Angereicherte neuronale Zellpopulationen sind wertvolle Werkzeuge sowohl für Laboruntersuchungen als auch für Zelltherapieanwendungen. Die verfügbaren Zellreinigungsverfahren erfordern jedoch teure Geräte wie FACS oder MACS, was ihre universelle Zugänglichkeit einschränkt. In dieser Studie haben wir eine effiziente Methode zur Reinigung unreifer neuronaler Zellen aus sich differenzierenden Nachkommen neuronaler Stammzellen (dNSC) entwickelt, basierend auf ihren unterschiedlichen Substratanhaftungseigenschaften, ohne teure Zelltrennwerkzeuge zu verwenden. Methoden: Mithilfe des Neurosphärentests wurden neuronale Stammzellen aus der Ganglione des Gehirns von Mäusen am 14. Tag der Embryonalentwicklung gewonnen. Die Neurosphären wurden dann in Einzelzellen dissoziiert und mithilfe der Neuroblastentestmethode differenziert. Nach einer kurzen Trypsinisierung wurde die dNSC-Kultur 30 Minuten lang vorsichtig bei 150 U/min geschüttelt, um die oberen neuronalen Zellcluster von der darunter liegenden astrozytischen Zellmonoschicht zu lösen. Die neuronale Reinigungsausbeute, die Astrozytenkontamination und das Vorhandensein sich teilender Zellen wurden mit einer MACS-Reinigungsmethode unter Verwendung des PSANCAM-Antikörpers verglichen. Ergebnisse: Während mit MACS eine neuronale Ausbeute von 97,1 ± 0,45 % erreicht wurde, erreichte sie mit der Schüttelmethode 97,9 ± 0,6 %, was keinen signifikanten Unterschied darstellt. Andererseits betrug der Prozentsatz der Astrozyten beim MACS-Ansatz 1,18 ± 0,15 %, sank jedoch mit der Schüttelmethode signifikant auf 0,6 ± 0,15 %. Darüber hinaus waren 4,41 ± 0,23 % und 5,3 ± 0,4 % der isolierten Zellen bei den MACS- bzw. Schüttelmethoden Ki-67-immunoreaktive sich teilende Zellen, von denen 97,34 ± 1,6 % und 97,9 ± 0,7 % β III-Tubulin coexprimierten, was ihre neuronale Identität bestätigte. Darüber hinaus führte die Schüttelmethode auf Grundlage des Tests zur Bildung neuronaler Kolonien zur Erzeugung einer homogenen neuronalen Zellpopulation ohne echte NSC-Kontamination. Schlussfolgerungen: Die Schüttelreinigungsmethode ermöglicht eine einfache, kostengünstige, effiziente und groß angelegte Trennung unreifer Neuronen von dNSC-Nachkommen, was sowohl grundlegenden als auch klinischen Anwendungen zugute kommen könnte.