Zeitschrift für Stammzellforschung und -therapie

Abstrakt

Auf LINE-1 basierende Insertionsmutagenese-Screenings zur Identifizierung von Genen, die an der Differenzierung embryonaler Stammzellen beteiligt sind

Sung-Hun Lee und Danny Rangasamy

Hintergrund: Kenntnisse über die intrinsischen Eigenschaften embryonaler Stammzellen sind unerlässlich, bevor die Möglichkeit besteht, diese Zellen für therapeutische Zwecke einzusetzen. Insertionsmutagenese-Screenings werden häufig eingesetzt, um Gene zu identifizieren, die ausreichen, um einen bestimmten Phänotyp zu erzeugen; die Anwendung solcher Ansätze ist jedoch auf Mausmodelle beschränkt. Daher besteht Bedarf an der Entwicklung eines neuen DNA-Transposonsystems, das Ansätze zur Genentdeckung in Stammzellen ermöglicht.
Methoden: Diese Studie wurde durchgeführt, um die Möglichkeit zu untersuchen, das Retrotransposon „long interspersed nuclear element 1“ (LINE-1) als Genfallenvektor zu verwenden, um Gene zu identifizieren, die an der Erhaltung und Differenzierung embryonaler Stammzellen von Mäusen beteiligt sind.
Ergebnisse: Wir haben ein episomales, nicht-virales LINE-1-Retrotransposonsystem entwickelt, indem wir die Gerüst-/Matrix-Anheftungsregionen im Rückgrat unseres Vektors verwendet haben. Dieser Genfallenvektor enthält einen GFP-Marker, dessen Expression nur nach erfolgreicher Insertionsmutagenese erfolgt. Durch die Verwendung dieses Vektors in Verbindung mit GFP-Expression konnten wir erfolgreich vier einzelne embryonale Stammzellklone isolieren, die gestörte Gene aufweisen, darunter zwei bekannte Gene. Anschließend bestätigten wir die Identität dieser Gene mithilfe eines inversen PCR-Verfahrens und verifizierten ihre Funktion bei der Zelldifferenzierung mithilfe von shRNAs und undifferenzierten Markern embryonaler Stammzellen .
Schlussfolgerungen: Die einfache Handhabung dieses Insertionsmutagens und die einfache Identifizierung der Zellen mit gestörten Genen durch GFP-Expression machen diesen LINE-1-Vektor zu einem vielversprechenden Instrument für die Entdeckung embryonaler Stammzellen und Krebsstammzellgene .