Zeitschrift für Stammzellforschung und -therapie

Abstrakt

Laser-Mikrodissektion muriner Interzonenzellen: Schichtauswahl und Vorhersage der RNA-Ausbeute

Florien Jenner, Gerjo JVM van Osch, Mairead Cleary, Iris Ribitsch, Ulrich Sauer, René van Weeren und Pieter Brama

Ziel: Gelenkknorpelzellen stammen aus einer bestimmten Kohorte von Progenitorzellen, die sich in der sogenannten Interzone in sich entwickelnden embryonalen Gelenken befinden. Wir haben diese Studie durchgeführt, um 1) festzustellen, ob es möglich ist, die mittleren und äußeren Interzonenschichten histologisch (mit Kresylviolett) ohne zusätzliche In-situ-Hybridisierung oder Immunhistochemie zu identifizieren; 2) festzustellen, ob aus jeder Interzonenschicht einzelner Embryonen ausreichende RNA-Mengen gewonnen werden können, um eine Genexpressionsanalyse zu ermöglichen; 3) Messungen zu entwickeln, die eine Schätzung der RNA-Ausbeute vor kostspieligen Amplifikationsschritten ermöglichen. Methoden: Zellen aus der äußeren (OI) und mittleren (II) Interzone des entstehenden Femorotibialgelenks und dem Epiphysenknorpel (EC) von Femur und Tibia von Mausembryonen mit einem Gestationsalter von 13,5 und 15,5 Tagen wurden mittels Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) gewonnen. Anschließend wurde eine Microarray-Analyse durchgeführt, um die geeignete Schichtauswahl zu bestätigen. Die geerntete Oberfläche und der Grauwert (gv) von während der LCM aufgenommenen Mikrofotografien wurden gemessen, die entsprechende relative optische Dichte (ROD) berechnet und Grad und Signifikanz der Korrelation mit der RNA-Ausbeute bestimmt. Ergebnisse: Zellen aus OI, II und EC konnten histologisch mittels Kresylviolettfärbung identifiziert werden und wurden erfolgreich mit LCM geerntet, wobei ausreichende Mengen RNA für eine lineare Amplifikation und Mikroarray-Analyse erzielt wurden. Die RNA-Ausbeute korrelierte signifikant mit der geernteten Gewebeoberfläche, dem mittleren gv und dem entsprechenden ROD. Schlussfolgerungen: Diese Studie bietet eine Technik zur selektiven Laser-Mikrodissektion und anschließenden Mikroarray-Analyse von murinen Interzonenzellen der Zwischen- und Außenschicht und präsentiert eine Methode zur Schätzung der RNA-Ausbeute durch Messung der geernteten Gewebefläche und Berechnung des ROD. Wir empfehlen, mindestens 1×106 μm2 von 13,5 Tage alten Mausembryonen und 3×106 μm2 von 15,5 Tage alten Mausembryonen zu entnehmen, um insgesamt etwa 10 ng RNA zu erhalten, die für die lineare T7-basierte Amplifikation und die anschließende Mikroarray-Analyse verwendet werden kann.