Zeitschrift für Karzinogenese und Mutagenese

Abstrakt

Verwendung des E18-Zellmodells zur Quantifizierung des mit DNA-Strangbrüchen verbundenen Bystander-Effekts (DSB-ABE)

Jalal Nasir

Die Lymphoblastenzelllinie E18 ist ein Derivat von TK6 und besitzt ein I-Sce1-Insert im Intron 2 des heterozygoten TK1 / tk1 -Gens. E18 kann mit der Restriktionsendonuklease I-Sce1 gezielt angesteuert werden, um Doppelstrangbrüche an der I-Sce1-Stelle zu induzieren und strahlungsunabhängige DNA-Schäden und den damit verbundenen Bystander-Effekt zu messen. Zur Konstruktion der Zelllinie E18 wurde eine Eco47III-Stelle in das linearisierte pTK-UAS-Plasmidrückgrat eingefügt und in Gegenwart von DNA-Ligase mit glattendigen Oligonukleotiden der Restriktionssequenz ISce1 geglüht. DH5-α-Zellen wurden durch Hitzetransfektion der Zellen mit pTK-UAS-Eco47III-Sce1 und Auswahl ampicillinresistenter Kolonien transformiert. Plasmid-DNA wurde extrahiert und auf das Vorhandensein von Eco47III- und I-Sce1-Stellen analysiert. Ein Klon mit einer I-Sce-Stelle in Intron 2 des aktiven Allels der Thymidinkinase wurde für weitere Experimente ausgewählt und E18 genannt. Dieses Modell wurde getestet, um die durch Doppelstrangbrüche induzierten Mutationen zu demonstrieren. Diese Strangbrüche können auch einen DNA-Strangbruch-assoziierten Bystander-Effekt (DSB-ABE) hervorrufen, der durch eine erhöhte Mutationshäufigkeit in naiven Zellen gemessen wurde. Das Plasmid pAdTrackCMV I-Sce1 mit GFP-Markierung wurde in E18-Zellen elektroporiert, um die I-Sce1-Restriktionsendonuklease zu exprimieren, die spezifisch auf die I-Sce1-Stelle in Intron 2 des aktiven TK-Allels abzielt. Ein Mutationsfraktionsassay wurde verwendet, um die direkte Mutationsfraktion (DMF) zu messen, oder begleitet von einem Transfer von konditioniertem Medium in naive Zellen, um die Bystander-Mutationsfraktion (BMF) als Endpunkt der Zielausrichtung auf E18 mit einer exogenen I-Sce1-Expression über pAdTrackCMV I-Sce1 zu messen, um DNA-Schäden zu induzieren und DMF und BMF zu quantifizieren.