Biochemie und analytische Biochemie

Abstrakt

Die Verwendung von Dichlorfluorescein als Sonde zur Überwachung der Auswirkungen von Kalzium auf die ROS-Produktion in Mitochondrien

Olga V. Akopova, Liudmila Kolchinskaya und Valentina Nosar

Dichlorfluorescein (DCF) wird häufig zur Überwachung der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in Zellen und isolierten Mitochondrien eingesetzt. Unser Ziel war es, verschiedene Ansätze zur Verwendung von DCF zur Überwachung der ROS-Bildung, die den Ca2+-Transport in isolierten Mitochondrien begleitet, zu vergleichen. Die Auswirkungen von Ca2+ auf die ROS-Produktion wurden in Rattenhirn- und Lebermitochondrien unter Verwendung von zwei DCF-Anwendungsmodi untersucht: Der erste bestand darin, die mitochondriale Stammsuspension mit dem DCF-Vorläufer Dichlorfluoresceindiacetat (DCFDA) vorzubeladen, und der andere war die Zugabe von DCFDA-Aliquoten direkt zum Inkubationsmedium. Calcium erhöhte die ROS-Produktion in Gehirn- und Lebermitochondrien sowohl unter stationären als auch unter Nichtgleichgewichtsbedingungen, was durch die allmähliche Freisetzung von Cytochrom c und die Steuerung des Elektronenflusses verursacht wurde. Mithilfe von DCF-vorgeladenen Mitochondrien haben wir gezeigt, dass die ROS-Bildungsrate unter Steady-State-Bedingungen linear von der Ca2+-Zyklusrate und der Ca2+-stimulierten Atmung abhängig war. Der Übergang in den Nichtgleichgewichtszustand führte zu einem nichtlinearen Anstieg der ROS-Bildung, der ebenfalls eine Abhängigkeit von der Ca2+-Konzentration aufwies. Während in DCF-vorgeladenen Mitochondrien die DCF-Fluoreszenz dem zeitlichen Verlauf des Ca2+-Transports genau folgte, störte die Sondenbeladung in unbelasteten Mitochondrien die Erkennung der ROS-Bildung aufgrund der kontinuierlichen Veränderung der DCF-Konzentration im Matrixraum. Basierend auf den Experimenten kamen wir zu dem Schluss, dass in Mitochondrien vorgeladenes DCF eine geeignete Sonde zur Überwachung der Auswirkungen des Ca2+-Transports auf die ROS-Produktion sein könnte.