Zeitschrift für biomolekulare Forschung und Therapeutik

Abstrakt

Die gleichzeitige Reinigung von humanem FVIII/vWF und Virusinaktivierung kombiniert in einer chromatographischen Säule

Sergiy P Havryliuk, Ievgenia M Krasnobryzha, Olena S Havryliuk und Georgii L Volkov

Es ist bekannt, dass die Verringerung der Anzahl der Freiheitsgrade die Denaturierung von Proteinen verhindert. In der vorherigen Untersuchung haben wir gezeigt, dass das chromatographische Gel-Bindeprotein als Mittel zur Verringerung der Anzahl der Freiheitsgrade des Proteins dienen kann. Darüber hinaus sorgte die hohe dynamische Kapazität neu entwickelter Gele für eine zufriedenstellende Retention des Peptids/Proteins bei erhöhter Temperatur des chromatographischen Prozesses. Diese beiden Faktoren ermöglichten die Durchführung der Virusinaktivierung für das Peptid (Streptokinasefragment SK1-61) und ein Protein mit niedrigem (Milchlysozym) und mittlerem (Fibrinogenolytisches Enzym aus dem Schlangengift) Molekulargewicht direkt in der Säule während der Zielisolierung. Ziel dieser Studie war die Untersuchung der Möglichkeit, die Aktivität des hochmolekularen Komplexes FVIII/vWF, der durch Ionenaustausch- und Affinitätsgele während der Virusinaktivierung gebunden wird, direkt in der chromatographischen Säule zu speichern. Ein weiteres Ziel war es zu zeigen, dass das bindende Proteinadsorbent als zuverlässiges „Sieb“ zum mechanischen Wegspülen infizierender Viren dienen kann. Mithilfe verschiedener chromatographischer, photometrischer und RT-PCR-Ansätze wurde festgestellt, dass die hohe dynamische Kapazität, die die hohe temperaturabhängige Kapazität des Adsorbens bestimmt, es ermöglichte, den virusinaktivierenden Komplex FVIII/vWF durch Lösungsmittel-/Detergensbehandlung direkt in der chromatographischen Säule bei einer Temperatur von 40–50 °C über einen langen Zeitraum von 3–5 Stunden durchzuführen. Die biologische Aktivität von FVIII blieb vollständig erhalten; umhüllte und nicht umhüllte Viren wurden effektiv entfernt. Der Grad der modellierten Viruseliminierung war für eine vollständige Inaktivierung von Viren ausreichend, sodass wir diese Methode für die Verwendung in der pharmazeutischen Industrie empfehlen konnten.