Zeitschrift für mikrobielle und biochemische Technologie

Abstrakt

Die Auswirkungen von Vorbehandlungen auf die qPCR-Erkennung von Bakterien - Bakterienindikator, Enterococcus als Modell

Shin Giek Goh und Karina Yew-Hoong Gin

Die aktuellen Richtlinien für Freizeitgewässer (z. B. USEPA und WHO) empfehlen Enterokokken als Indikator für Süß- und Meerwasser. Kulturbasierte Methoden werden seit Jahrzehnten verwendet, um das Vorhandensein von Enterokokken zu quantifizieren. Im Jahr 2012 wurde qPCR in die USEPA-Richtlinie für Freizeitgewässer aufgenommen, da dort qPCR als alternative Methode zum Nachweis von Enterokokken aufgenommen wurde. Die qPCR-Methode erfordert im Gegensatz zur kulturbasierten Methode keine so lange Inkubationszeit. Darüber hinaus bietet sie die Vorteile einer hochspezifischen und empfindlichen Erkennung. Dennoch wird qPCR durch drei wesentliche limitierende Faktoren behindert. In dem kleinen Probenvolumen, das per qPCR analysiert wird, sind nur begrenzt Zielzellen vorhanden, es sind Inhibitoren vorhanden, die den empfindlichen Nachweis von qPCR leicht beeinträchtigen können, und es gibt Persistenz freier DNA (von toten Zellen freigesetzte DNA), die das falsch positive Signal bei qPCR verursacht. Daher sind die vorgelagerten Behandlungen entscheidend für die Genauigkeit des qPCR-Nachweises. Drei verschiedene Vorkonzentrationsmethoden: (i) Filtration mit Nylonmembran; (ii) Filtration mit Polycarbonatmembran und (ii) Zentrifugation wurden auf ihre Rückgewinnungsrate untersucht. Die Filtration mit Polycarbonatmembran erwies sich als effizienter und konsistenter, unabhängig von der Probenmatrize. Konventionelle DNA-Extraktion und zwei im Handel erhältliche DNA-Extraktionskits wurden hinsichtlich der Reinheit der extrahierten DNA und der relativen Rückgewinnungseffizienz der Extraktion bewertet. Die Ergebnisse zeigen, dass das im Handel erhältliche Kit, das QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen), die beste Leistung lieferte. Die Verwendung von Silica-Membranen im QIAamp® DNA Mini Kit verbesserte nachweislich die DNA-Rückgewinnung bei minimaler Interferenz von Inhibitoren. Ethidiummonoazid (EMA) und Propidiummonoazid (PMA) wurden auf ihre Leistung bei der Verringerung falsch-positiver Signale bei qPCR bewertet. PMA erwies sich als die bessere Möglichkeit, falsch-positive DNA-Nachweise in einer membrangeschädigten Zelle zu verringern.