Zeitschrift für Pflanzenpathologie und Mikrobiologie

Abstrakt

Spezifischer Nachweis von Klebsiella variicola und K. oxytoca durch Loop-Mediated Isothermal Amplification

Jarred Yasuhara-Bell, Caleb Ayin, April Hatada, Yonghoon Yoo, Robert L. Schlub und Anne M. Alvarez

Klebsiella spp. sind opportunistische Pathogene mit klinischen, veterinärmedizinischen und pflanzenassoziierten Isolaten. Eine vorherige Studie zeigte, dass Bakterienschleim aus Feuchtholz stark abgestorbener Eisenholzbäume auf Guam Ralstonia solanacearum , Klebsiella variicola und K. oxytoca enthielt. In dieser Studie wurden K. variicola und K. oxytoca mittels Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) spezifisch nachgewiesen, wobei einzigartige Primer-Sets verwendet wurden, die individuell für jeden Organismus entwickelt wurden. Jedes LAMP erkannte sein Ziel spezifisch, zeigte aber negative Ergebnisse für Nicht-Zielbakterien und Negativkontrollen. LAMP erkannte Klebsiella in inokuliertem Eisenholzstammgewebe und Bakterienschleim. Aufgrund der Anwesenheit von Pflanzeninhibitoren wurden unterschiedliche Probenahmeprotokolle getestet. Das Einweichen von Pflanzengewebeproben, um die Diffusion der Bakterien in die Lösung zu ermöglichen, und anschließende Kochen ermöglichte eine optimale Erkennung von Klebsiella direkt aus den Pflanzenproben. Falsche Negativergebnisse bei der Verwendung zerkleinerter Pflanzenproben wurden durch einen Anreicherungsschritt mit Beschichtung und 12-stündiger Inkubation eliminiert. DGGE (denaturierende Gradientengelelektrophorese) und ein Kolonieblot- Immunoassay mit einem Klebsiella-spezifischen Antikörper konnten Klebsiella auch in inokuliertem Eisenholz nachweisen. DGGE-Banden und Antikörper-Kreuzreaktionen von eng verwandten Enterobacter-Bakterien zeigten das Potenzial für falsch positive Ergebnisse. Aufgrund seiner Beschaffenheit eignet sich LAMP ideal für Point-of-Care-Tests und zeigt in Kombination mit der Spezifität der in dieser Studie entwickelten LAMP-Primer sein Potenzial als routinemäßiger Feldtest für Klebsiella in Eisenholz auf Guam sowie für die klinische und veterinärmedizinische Diagnose einer Klebsiella-Infektion. Darüber hinaus sind die in dieser Studie zur Erkennung anvisierten Regionen für alle Formen der molekularen Diagnostik anwendbar.