Gentechnologie

Abstrakt

Rekombinante humane Proinsulinexpression in E. Coli durch Veränderung der 5ʹ-untranslatierten und translatierten Region

Aslam F, Latif K, Waseem R, Naz S und Iftikhar S

Messenger-RNA leitet den Übersetzungsprozess ein, indem sie den Code der DNA auf Transfer-RNA überträgt. Eine an Polypurinen reiche Sequenz namens Shine-Dalgarno-Sequenz hilft dabei, die Position des Startcodons zu bestimmen. Die Shine-Dalgarno-Sequenz ist anders, weil sie durch direkte Bindung ermöglicht an diese Sequenz den Aufbau des Ribosoms an einer inneren Position auf der mRNA. Die ribosomale Bindungsstelle am 5'-Ende der Translationsinitiierungsstelle wird zur Bindung der sekundären mRNA-Struktur verwendet. Der Abstand zwischen RBS und Startcodon beeinflusst die Translationseffizienz eines Gens. In dieser Studie verändern wir den Abstand zwischen der Ribosomenbindungsstelle und dem Startcodon, um unterschiedliche Verhältnisse der translationalen Expression zu erhalten. Zu diesem Zweck wurde das Proinsulingen in den Vektor pET21a geklont, der Abstand zwischen der Bindungsstelle und dem Startcodon wurde auf 8 Nukleotide belassen. Bei diesem Abstand zwischen der Ribosomenbindungsstelle (RBS) und dem Startcodon betrug die Expression von Proinsulin 30 % der gesamten Zellproteine. Wenn 10 Nukleotide dazwischen liegen, verringert sich die Expression um bis zu 2–4 %. Bei 12 Nukleotiden zwischen RBS und Startcodon verringerte sich die Expression weiter um bis zu 1–2 %. Da diese Versuche zufällig erfolgten, zeigte die Überprüfung der mRNA-Sekundärstrukturen mit mehrfacher Genauigkeit eine Bindung zwischen der Ribosomenbindungsstelle und dem Start des Proinsulinens. Ein weiterer Versuch, durch Einbau von zehn verschiedenen Nukleotiden am Start des Proinsulins die Sekundärstruktur der mRNA weniger stabil zu machen (ΔG = -5,5), veränderte die Expression von Proinsulin in Zellen mit BL21-Codon plus nicht signifikant. Es gibt andere Faktoren, die die Proteinexpression kontrollieren, z. B. metabolische Instabilität, schnellerer Abbau von mRNA oder Proteinansammlung, die die Expression von mRNA herunterregulieren können.