Biochemie und analytische Biochemie

Abstrakt

Reinigung und Charakterisierung von Methionin-Gamma-Lyase-Deaminase (Mgld) aus dem oralen pathogenen Organismus Porphyromonas gingivalis

David Morcos1, Brad J Schmier, Arun Malhotra und Venkatachalam KV 

Porphyromonas gingivalis ist ein orales pathogenes Bakterium, das bei Menschen Mundgeruch (Halitosis) und Parodontitis verursacht . Mundgeruch wird durch flüchtige Schwefelverbindungen wie Methylthiol verursacht, die beim Abbau von Methionin durch Methionin-Gamma-Lyase-Deaminase (Mgld) entstehen. In diesem Bericht haben wir Porphyromonas gingivalis mgld mithilfe eines bakteriellen Expressionssystems geklont und exprimiert. Das gereinigte homotetramere Enzym wurde mithilfe eines neuartigen Isotopentests unter Verwendung von L-[1-14C]-Methionin als Substrat charakterisiert. Mgld ist eine PLP-abhängige L-Methionin-CS-Lyase-Deaminase, die die Gamma-Kohlenstoff-Schwefel-Bindung von L-Methionin zu Methylthiol spaltet und das desaminierte Gesamtprodukt α-Ketobutyrat bildet. Wir stellen fest, dass exogenes 3H-L-2-Aminobutyrat unter Bedingungen eines Enzymüberschusses nicht zu 3H-α-Ketobutyrat desaminiert wird, was einen effizienten Transfer gebundener Zwischenprodukte während des L-Methionin-Katabolismus unterstützt. Die Gesamtreaktion zur Bildung von α-Ketobutyrat aus L-Methionin weist einen Km von 1,0 mM, einen Vmax von 5,27 μmol min-1 mg-1 und einen monomeren kcat/Km von 3729,3 M-1 s-1 auf. Mgld weist optimale Aktivität über pH 8 und in einem Temperaturbereich von 37°-50°C auf. Mehrere Verbindungen wurden auf Mgld-Hemmung getestet. Das Naturprodukt DL-Propargylglycin sticht als wirksamster Mgld-Hemmer hervor und könnte daher zur Bekämpfung von Mundgeruch nützlich sein. Mgld zeigt nahezu keine Aktivität gegenüber N-Formylmethionin, was bestätigt, dass zur Bildung einer Schiffschen Base mit dem Enzym ein freier α-Aminostickstoff auf dem Substrat erforderlich ist.