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Abstrakt
Profilierung der Monoacylglycerol-Lipase-Aktivität im Rattenhirn mittels eines Ammoniak-Addukt-verstärkten, selektiven Ionen-Monitoring-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-Assays mit positiver Elektrospray-Ionisation
Gary W. Caldwell und Wensheng Lang
2-Arachidonoylglycerole (2-AG) sind eines der wichtigsten Endocannabinoide im zentralen Nervensystem. Die Hochregulierung der zentralen Endocannabinoid-Signalisierung durch selektive Hemmung der Aktivität der Monoacylglycerol-Lipase (MAGL) im Gehirn ist ein potenzieller therapeutischer Ansatz bei Schmerzen, Fettleibigkeit und Diabetes-Modulation, um nur einige zu nennen. Daher ist eine empfindliche und zuverlässige Analysemethode zur Bestimmung der Endocannabinoid-Werte im Gehirn für die Entdeckung von MAGL-Hemmern von entscheidender Bedeutung. Die genaue Messung der Monoacylglycerol-Werte (MAG) mithilfe der Flüssigchromatographie mit positiver Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (LC / +ESI / MS) und Tandem-MS ist eine Herausforderung, da die Endocannabinoide im Gehirn nicht nur in der Lebensphase der Studie stressanfällig sind, sondern auch zu postmortalem Metabolismus, Acylmigration (d. h. Umwandlung von 2-MAG in 1(3)-MAG), Metalladduktions-Ionenbildung und chemischer Hydrolyse neigen, wodurch dieselben Produkte wie durch das Zielenzym erzeugt werden. Um diese Artefakte zu vermeiden, haben wir eine einfache LC/+ESI/MS-Methode zur direkten Erkennung von Ammoniumaddukt-Kationen der wichtigsten MAGs im SIM-Modus (Selected Ion Monitoring Mode) entwickelt. Für den In-vitro-MAGL-Hemmtest wurde eine isokratische LC-Elution zur Basistrennung von MAGs und ihren Acylmigrationsisomeren verwendet, die während der 37 °C-Inkubation mit Rattenhirnhomogenat entstanden. Um den postmortalen Stoffwechsel und die Isomerisierung von MAGs für In-vivo-Studien zu minimieren, wurde das Rattenhirn direkt in vier Milliliter Ethanol pro Gramm Hirngewebe homogenisiert und eine lineare LC-Gradientelution für ein breites Endocannabinoid-Profiling angewendet. Die SIM LC/+ESI/MS-Methode hat sich als nützlich erwiesen für die In-vitro-Gehirnbewertung der Hemmwirkung von MAGL- und Fettsäureamidhydrolase-(FAAH)-Hemmern und für die In-vivo-Gehirnbewertung für Zielbindungsstudien.