Abstrakt

Molekulare Klonierung und Expression von Cellulase- und Polygalacturonase-Genen in E. coli als vielversprechende Anwendung für die Biokraftstoffproduktion

Eman Ibrahim, Kim D. Jones, Ebtesam N. Hossenya

0Lignozellulose-Biomasse hat das Potenzial für Bioethanol, einen erneuerbaren Kraftstoff. Eine Einschränkung besteht darin, dass die Biokonversion des komplexen lignozellulosehaltigen Materials in einfache Zucker und dann in Bioethanol ein anspruchsvoller Prozess ist. Neuere Arbeiten haben sich auf die genetische Veränderung eines Biokatalysators konzentriert, der eine entscheidende Rolle bei der Biokraftstoffproduktion spielen könnte. Escherichia coli gilt als geeigneter Wirt für Biokatalysatoren bei der Biokraftstoffproduktion, da es Glucose zu einer Vielzahl kurzkettiger Alkohole fermentiert und stark desoxygenierte Kohlenwasserstoffe produziert. Das Bakterium Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (P. carotovorum) ist bekannt für seine Mazeration der Zellwände von Pflanzen, die Weichfäule verursacht. Die Fähigkeit, Pflanzen zu zerstören, beruht auf der Expression und Sekretion einer Vielzahl hydrolytischer Enzyme, darunter Cellulasen und Polygalacturonasen. P. carotovorum ATCC™-Nr. 15359 wurde als DNA-Quelle für die Amplifikation von celB, celC und peh verwendet. Diese Gene kodieren jeweils 2 Cellulasen und eine Polygalacturonase. Primer wurden auf Grundlage veröffentlichter Gensequenzen entwickelt und verwendet, um die offenen Leserahmen aus der genomischen DNA von P. carotovorum zu amplifizieren. Die einzelnen PCR-Produkte wurden in den Expressionsvektor pTAC-MAT-2 kloniert und in Escherichia coli transformiert. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der klonierten Gene wurden auf ihre katalytisch aktiven Domänen hin analysiert. Die Schätzung der Molekulargewichte der exprimierten Proteine ​​erfolgte mittels SDS-PAGE-Analyse und die Produkte celB, celC und peh wogen jeweils ungefähr 29,5 kDa, 40 kDa und 41,5 kDa. Die qualitative Bestimmung der Cellulase- und Polygalacturonase-Aktivitäten der klonierten Gene erfolgte mittels Agardiffusionstests.

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