Biologie und Medizin

Abstrakt

Lipopolysaccharid (LPS) und Protein-LPS-Komplexe: Nachweis und Charakterisierung mittels Gelelektrophorese, Massenspektrometrie und Bioassays

Eugenio Hardy, Caridad Rodriguez und Luis E. Trujillo

Eine umfassende Strukturanalyse der LPS-Arten ist eine Voraussetzung für die Entdeckung und Charakterisierung der Interaktion von Lipopolysacchariden (LPS) mit spezifischen Rezeptoren und der daraus resultierenden pathophysiologischen Wirkungen. Dieser kurze Überblick soll den Einsatz der Gelelektrophorese in Verbindung mit anderen biochemischen Technologien zur Erkennung und Charakterisierung von LPS zusammenfassen. Lipopolysaccharidaggregate allein oder Mischungen aus LPS und Proteinen/Peptiden können durch native Agarose-Gelelektrophorese (NAGE) getrennt werden, wonach die LPS mit Imidazol und Zinksalzen nachgewiesen werden. Ein Doppelfärbeverfahren mit Coomassie-Brilliantblau R-250 ermöglicht den Einsatz von NAGE zur Erkennung und Untersuchung von Protein-LPS-Interaktionen. Zur Zusammensetzungsanalyse werden die LPS-Aggregate durch Tensid-Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit hoher Auflösung getrennt. Nach der Rückfärbung mit Zink-Imidazol und Elution von Gelmikropartikeln sind glykoformspezifische LPS bereit für die Struktur- und biologische Analyse. Für die Sequenzanalyse von Oligosacchariden auf Basis der Tandem-Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS/MS) werden LPS einer milden Säurehydrolyse, Dephosphorylierung und Permethylierung unterzogen. Außerdem können O-deacylierte LPS-Formen durch matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation-Flugzeit-MS analysiert werden. Im Vergleich zu Spektren von nicht gereinigten LPS zeigen Massenspektren der mikrogereinigten LPS eine geringere Heterogenität und ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis. Darüber hinaus ermöglicht die Mikroreinigung von LPS vor der MS eine höhere Nachweisempfindlichkeit für weniger häufig vorkommende LPS-Glykoformen. Die mikrogereinigten LPS-Fraktionen können zur Bildung selbstorganisierter Nanoaggregate verwendet werden, die durch dynamische Lichtstreuung nachgewiesen werden können. Die Auswirkung der O-Seitenkettenlänge auf das Z-Potenzial von LPS-Aggregaten kann durch Messungen auf Basis der Laser-Doppler-Elektrophorese geschätzt werden. Die auf diese Weise erhaltenen Glykoform-spezifischen LPS sind nicht nur chemisch intakt, sondern auch biologisch aktiv, wie beispielsweise durch den Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test, den TNF-α-Test und die agonistische Wirkung auf den humanen Toll-like-Rezeptor 4 nachgewiesen wurde.