Biochemie und analytische Biochemie

Abstrakt

Einfluss makromolekularer Dichte und Eingrenzung auf Enzymaktivität und -struktur unter nativen und denaturierenden Bedingungen

Steven Long, Jeffrey Kunkel und Prashanth Asuri

Es ist mittlerweile allgemein anerkannt, dass sowohl Überfüllung als auch Einschluss aufgrund ausgeschlossener Volumeneffekte die Struktur und Funktion von Enzymen beeinflussen. Die relative Wirksamkeit dieser Umgebungen auf das Proteinschicksal bleibt jedoch aufgrund fehlender direkter Vergleichsstudien unklar. In dieser Studie untersuchen wir die Verwendung des Biopolymers Alginat, um eine In-vitro -Plattform zu entwickeln, mit der die Auswirkungen von Überfüllung und Einschluss auf das Verhalten zweier Modellenzyme – Meerrettichperoxidase und β-Galaktosidase – untersucht werden können. Alginat kann in seiner Lösungsphase als Überfüllungsmittel und in seiner Gelphase durch Vernetzung mit zweiwertigen Kationen zum Einkapseln und Einschluss von Proteinen verwendet werden, wodurch wir dasselbe System verwenden können, um die Auswirkungen von Überfüllung und Einschluss direkt zu vergleichen. Durch Variation der Alginatkonzentration wurden unterschiedliche Grade von Überfüllung und Einschluss erreicht, und diese Studien zeigten eine klare Abhängigkeit der Enzymaktivität vom Grad der Überfüllung und Einschluss. Darüber hinaus wiesen unsere Daten auch darauf hin, dass die Proteineinschließung in vernetzten Alginatgelen zu einer stärkeren Steigerung der Enzymaktivität unter denaturierenden Bedingungen führte als in nicht vernetzten, überfüllten Umgebungen. Die Ergebnisse der kinetischen Analysen wurden durch Strukturmessungen der Proteindenaturierung unter Verwendung des 8-Anilinonaphthalin-1-sulfonsäure-Fluoreszenztests bestätigt.