Zeitschrift für Bioäquivalenz und Bioverfügbarkeit

Abstrakt

Quantifizierung von Hydroxocobalamin in menschlichem Plasma mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie in einer pharmakokinetischen Studie

Gustavo D. Mendes, Fabiana D. Mendes, Marinalva Ferreira Sampaio, Antonio Sergio Silveira, Lu Shi Chen, Khalid M. Alkharfy und Gilberto De Nucci

Es wird eine schnelle, empfindliche und spezifische Methode zur Quantifizierung von Hydroxocobalamin in menschlichem Plasma unter Verwendung von Paracetamol als internem Standard (IS) beschrieben. Der Analyt und der IS wurden durch Flüssig-Flüssig-Extraktion unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels (Ethanol 100 %; -20 °C) aus dem Plasma extrahiert. Die Extrakte wurden mittels Hochleistungsflüssigchromatographie in Verbindung mit Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MS-MS) analysiert. Die Chromatographie wurde auf einer analytischen Säule Prevail C8 3 μm (2,1 × 100 mm Innendurchmesser) durchgeführt. Die Methode hatte eine chromatographische Laufzeit von 3,4 min und eine lineare Kalibrierungskurve über den Bereich von 5 bis 400 ng.mL-1 (r > 0,9983). Die Quantifizierungsgrenze lag bei 5 ng.mL-1. Die Methode wurde auch ohne Verwendung des internen Standards validiert. Die Präzision bei der Intra-Batch-Validierung mit IS betrug 9,6 %, 8,9 %, 1,0 % und 2,8 %, während sie ohne IS 9,2 %, 8,2 %, 1,8 % und 1,5 % für 5, 15, 80 bzw. 320 ng/ml betrug. Die Genauigkeit bei der Intra-Batch-Validierung mit IS betrug 108,9 %, 99,9 %, 98,9 % und 99,0 %, während sie ohne IS 101,1 %, 99,3 %, 97,5 % und 92,5 % für 5, 15, 80 bzw. 320 ng/ml betrug. Die Präzision bei der Inter-Batch -Validierung mit IS betrug 9,4 %, 6,9 %, 4,6 % und 5,5 %, während sie ohne IS 10,9 %, 6,4 %, 5,0 % und 6,2 % für 5, 15, 80 bzw. 320 ng/ml betrug. Die Genauigkeit bei der Inter-Batch-Validierung mit IS betrug 101,9 %, 104,1 %, 103,2 % und 99,7 %, während sie ohne IS 94,4 %, 101,2 %, 101,6 % und 96,0 % für 5, 15, 80 bzw. 320 ng/ml betrug. Dieses HPLC-MS-MS-Verfahren wurde verwendet, um die Pharmakokinetik von Hydroxocobalamin nach intramuskulärer Injektion von 5000 μg bei gesunden Freiwilligen beiderlei Geschlechts (10 Männer und 10 Frauen) zu bewerten. Die Freiwilligen wiesen die folgenden klinischen Merkmale auf (nach Geschlecht und ausgedrückt als Mittelwert ± SD [Bereich]): Männer: Alter: 32,40 ± 8,00 Jahre [23,00 – 46,00], Größe: 1,73 ± 0,07 m [1,62 – 1,85], Körpergewicht: 72,48 ± 10,22 kg [60,20 – 88,00]; Frauen: Alter: 28,60 ± 9,54 Jahre [18,00 – 44,00], Größe: 1,60 ± 0,05 m [1,54 – 1,70], Körpergewicht: 58,64 ± 6,09 kg [51,70 – 66,70]. Die folgenden pharmakokinetischen Parameter wurden aus den Kurven der Hydroxocobalamin-Plasmakonzentration gegenüber der Zeit ermittelt: AUClast, T1/2, Tmax, Vd, Cl, Cmax und Clast. Die pharmakokinetischen Parameter waren 120 (± 25) ng/ml für Cmax, 2044 (± 641) ng.h/ml für AUClast, 8 (± 3,2) ng.ml-1 für Clast, 38 (± 15,8) Stunden für T1/2 und 2,5 (Bereich 1-6) Stunden für Tmax. Bei weiblichen Probanden war die AUC (1706 ± 704) ng.h/ml) signifikant niedriger (p=0,0136) und die Clearance (2,91 ± 1,41 l/h) höher (p=0,0205) als bei männlichen Probanden (2383 ± 343 ng.h/ml bzw. 1,76 ± 0,23 l/h). Diese pharmakokinetischen Unterschiede könnten die höhere Prävalenz eines Vitamin-B12-Mangels bei weiblichen Patienten erklären . Die beschriebene Methode war auch ohne Verwendung des internen Standards gut validiert und dieser Ansatz sollte in anderen HPLC-MS-MS-Methoden untersucht werden.