Einzelzellbiologie

Abstrakt

Genotypisierung von einzeln isolierten Gameten aus Chromosomensubstitutionslinien von Gossypium hirsutum

Ahmad Naseer Aziz*, Abdul Mujeed Yakubu und Sherya Singh Hamal

Da Baumwolle eine wichtige Nutzpflanze für die landwirtschaftliche Sicherheit und nachhaltige Landwirtschaft in den USA ist, erfordert ihre genetische Verbesserung die Entwicklung innovativer Analyseinstrumente. Genetische Analysen auf der Grundlage einzelner Gameten bieten mehrere Vorteile, darunter einen minimalen Probenbedarf, die genetische Identifizierung des männlichen Elternteils und die Überwindung der Komplexität der Polyploidie aufgrund der haploiden Natur der Mikrosporen. In dieser Forschung wurden tetraploide Baumwolllinien mit Chromosomensubstitution (CS) (G. hirsutum x G. barbadense) mit den Chromosomen 17 und 25 von G. barbadense im G. hirsutum-Hintergrund verwendet. Die einzeln isolierten Pollenkörner wurden zum Keimen gebracht, um ihre DNA freizusetzen, und die genomische DNA wurde durch modifizierte Primer-Extension-Präamplifikation (PEP) unter Verwendung des MasterAmp™ Extra-Long PCR Kit (EPICENTRE®, Madison, WI) vermehrt. Außerdem wurden aus ausgewählten Baumwolllinien gerade aus dem Tetraden-Entwicklungsstadium freigesetzte Mikrosporen einzeln isoliert und Gameten-DNA extrahiert sowie durch multiple Displacement-Amplifikation (MDA) unter Verwendung des REPLI-g Single Cell Kit (QIAGEN, Valencia, CA) amplifiziert. Die Elternproben wurden dann zusammen mit PEP- und MDA-amplifizierten einzelnen Gameten-DNAs mithilfe von Simple Sequence Repeat (SSR) sowie IRD800- und IRD-700-markierten (Li-Cor, Lincoln, NE) Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)-Methoden analysiert. Neunzehn SSR- und 28 AFLP-Primerpaare wurden verwendet, um die Baumwolllinien TM-1, 3-79, CS-B17 und CS-B25 zu analysieren. Die Amplifikation der Eltern-SSR- und AFLP-Marker sowohl aus reifen Pollen als auch aus frühen freien Mikrosporenproben lieferte einzigartige Werkzeuge für vergleichende genetische Studien unter Verwendung von Agarose- bzw. Polyacrylamid-Gelelektrophorese.