Zeitschrift für mikrobielle und biochemische Technologie

Abstrakt

DNA-Spiral-Supercoiling und intramolekulare topologische Verbindung

Xitai Huang, Jia Yu, Zhenfeng Zhang und Kou Cao

Es wurde früher beobachtet, dass die chromosomale DNA von Escherichia coli aus Untereinheiten einer archimedischen spiralförmigen Superspirale besteht. Wie Zellen eine derartige DNA-Struktur aufbauen, ist unbekannt. In der vorliegenden Studie zeigten Bilder der Rasterkraftmikroskopie (AFM), dass superspiralisierte pBR322-DNA bei Interkalation mit 0,5 μg/ml Ethidiumbromid (EB) eine Spiralstruktur bildet, was bislang als superhelikale Dichte von null galt. Neuere Erkenntnisse legen nahe, dass eine neuartige topologische Bindung, die intramolekulare topologische Verbindung (ITL), die DNA-Spiralbildung fördert. Ohne Interkalation weist die superspiralisierte pBR322-DNA eine plektonämische Superspirale mit ungleichmäßiger Verteilung der Superspiraldichte auf. Ähnliche Beobachtungen wurden auch gemacht, wenn die DNA übermäßig mit EB (20 μg/ml) interkaliert war. Die Ergebnisse zeigten, dass ITL als Bremse fungiert, um die Verdrehung der helikalen Doppelstränge zu blockieren und die zirkuläre DNA in Bereiche unterschiedlicher superhelikaler Dichte aufzuteilen. Wenn DNA in alkalischer Lösung denaturiert wurde, zeigten AFM-Bilder, dass das ITL konstant blieb. Als die denaturierte pBR322-DNA mit der Restriktionsendonuklease PstI geschnitten wurde, behielt die verdaute DNA intramolekulare Verbindungen bei, die zu einem Zentrum mit zwei freien Schnittenden zusammenliefen. Vernetzte Zwischenprodukte können beobachtet werden, wenn natürliche pBR322-DNA mit HindIII und der ortsspezifischen Nickase Nb. Bpu10I verdaut wurde. Alle Hinweise deuten darauf hin, dass ITL in pBR322-DNA vorhanden ist und eine DNA-Spiralsupercoiling verursacht. Es wurde festgestellt, dass die DNA-Topoisomere mit unterschiedlicher ITL-Nummer in der Elektrophorese eine Leiter aus Bändern bilden, die sich von den DNA-Topoisomeren unterscheidet, die von der E. coli-Gyrase produziert werden und einen Schmierfleck bilden. In einem zellfreien System, das E. coli-Zellextrakt enthält, zeigen wir, dass Topoisomerase IV für die Produktion von ITL-DNA-Topoisomeren aus entspanntem cccDNA-Substrat erforderlich ist. Zusammengefasst deuten unsere Daten darauf hin, dass ITL ein neuartiges Element der DNA-Topologiestruktur darstellt. Die DNA-Spiral-Superspirale könnte eine universelle Struktur in der Zelle sein.