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Abstrakt
Entwicklung von quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsprotokollen zur schnellen Erkennung und Differenzierung von Xylella fastidiosa subsp. fastidiosa und Xylella fastidiosa subsp. multiplex
Brittany Pierce, Lisa Morano und Blake Bextine
Xylella fastidiosa ist ein gramnegatives, xylembegrenztes, pflanzenpathogenes Bakterium, das durch den Glasflügeligen Scharfschützenkäfer (Homalodisca vitripennis) zwischen Wirten übertragen wird. Es gibt mehrere Unterarten von X. fastidiosa, die ein gewisses Maß an Wirtsspezifität aufweisen. X. fastidiosa subsp. fastidiosa ist der Erreger der Pierce-Krankheit der Weinrebe. X. fastidiosa subsp. multiplex und X. fastidiosa subsp. sandyi kommen häufig in Nordamerika vor, verursachen aber keine Pierce-Krankheit. Für eine effektive Behandlung und Vorbeugung der Pierce-Krankheit sind schnelle Diagnosen zur Feststellung des Vorhandenseins von X. fastidiosa und zur Differenzierung dieser Unterarten erforderlich. In dieser Studie wurden drei Methoden zur Unterscheidung von X. fastidiosa-Unterarten mithilfe der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit verglichen. SYBR ® Green-, Eva Green ® - und Takara SYBR Green ®-Schmelzkurvenanalysen von partiellen GyraseB-Amplikons, Zot1-Gen-Amplikons und fünf tonB-Amplikons wurden auf Konsistenz und Qualität untersucht. Es wurden Diagnoseprotokolle auf Basis von TaqMan ® und Molecular Beacon ®-Hybridisierungssonden entwickelt, wobei der Schwerpunkt auf einer Multiplex-Insertion von X. fastidiosa subsp. im Zot1-Gen lag. Wir stellten fest, dass auf SYBR ® Green und TaqMan ® basierende Diagnoseprotokolle nicht die notwendige Auflösung für eine genaue und konsistente Differenzierung von X. fastidiosa-Unterarten lieferten. Von uns entwickelte Diagnoseprotokolle unter Verwendung der Molecular Beacon ®-Sonde ermöglichen eine hochspezifische und zuverlässige Differenzierung von X. fastidiosa-Unterarten, selbst in Fällen, in denen Unterarten in Lösung gemischt wurden. Diese neuen Methoden bieten ein zuverlässigeres Protokoll, mit dem die Unterarten von X. fastidiosa für Laboruntersuchungen und Probendiagnostik rasch identifiziert werden können.