Globales Journal für Biologie, Agrar- und Gesundheitswissenschaften

Abstrakt

Entwurf, Optimierung und Validierung eines Durchflusszytometrie-Tests zur Quantifizierung von Igg-Anti-D (rho) in der industriellen Prozesskontrolle der Anti-Rho-Gammaglobulin-Produktion

Sergio A. Oviedo, Susana Vitali, Jorge Zarzur

Eine der Hauptursachen für die Hämolyse bei Neugeborenen ist die Bildung von Anti-D-Antikörpern als Reaktion auf eine kontinuierliche Antigenbelastung bei schwangeren Müttern, deren rote Blutkörperchen kein D-Antigen aufweisen. Um Komplikationen vorzubeugen, wird der Anti-D-Antikörperspiegel bei schwangeren Frauen überwacht und die Sensibilisierung durch Prophylaxe mit Anti-D-Immunglobulin (IgG Anti-D) verhindert. Bis heute wird die Überwachung und Titration von Anti-D in Plasma und Fertigprodukten (IgG Anti-D) mittels kontinuierlicher Durchflussanalyse mit einem Technicon Autoanalyzer, Radio Immuno Assay (RIA) und Enzymo Immuno Assay (EIA) durchgeführt. In unserem Labor wurde zur Quantifizierung von Anti-D-Antikörpern des Gamma-Rho UNC und der Produkte des Herstellungsprozesses eine „hausgemachte“ Durchflusszytometrietechnik als alternativer Test zur Referenzmethode des Europäischen Arzneibuchs entwickelt. Polyklonale Anti-Rho-Antikörper und ein mit Anti-FITC (Fluoresceinisothiocyanat) markiertes menschliches IgG wurden verwendet, um die Konzentration von Anti-D-Antikörpern in einem kommerziellen Präparat aus Gammaglobulin, halbverarbeitetem und menschlichem Plasma zu messen. Die Methode wurde unter Verwendung des 1. internationalen WHO-Standards für Anti-D-IgG (69/419) entwickelt. Bei der in der Methode verwendeten Konzentration der roten Blutkörperchen (5 x 104 Zellen/ul) gibt es keine Interferenz durch Autoagglutination. Die erhaltene Dosis-Wirkungs-Kurve (MFI vs. Log C) war im angenommenen Arbeitsbereich linear und wies einen Korrelationskoeffizienten von 0,99 auf. Die Spezifitäts- und Wiederfindungstests waren zufriedenstellend, die Negativkontrollen zeigten unbedeutende Fluoreszenzwerte und stellten keine ernsthafte Interferenz bei der Bestimmung dar. Da bekannt ist, dass die Antigenkonzentrationen der Erythrozyten je nach Phänotyp variieren, zeigen unsere Ergebnisse, dass die Kügelchen mit den Phänotypen R1R1 die beste Leistung für diesen Test aufweisen und bei Bedarf durch R1R2-Zellen ersetzt werden können. Die Methode wurde gemäß den Kriterien der Expertengruppe Nr. 6B des NIBSC und des Europäischen Arzneibuchs validiert, die ein ähnliches Verfahren zur Bewertung von Anti-D standardisiert haben. Die Durchflusszytometrie ermöglichte genaue, präzise, ​​empfindliche und spezifische Bestimmungen bei verschiedenen Anti-D-Konzentrationen (100-0,9 µg/ml) und in verschiedenen biologischen Matrices wie Fertigprodukt, vorgefülltem Konzentratprodukt und Fraktion II der Cohn-Methode. Zu den Vorteilen der Anwendung dieser Methode gehören neben den relativ geringen Kosten ein starkes Fluoreszenzsignal, das keiner Verstärkung bedarf, und die Verwendung stark verdünnter Proben, die das Risiko einer Agglutination durch IgM-Anti-D oder Polymere minimieren. Es handelt sich um eine einfache, schnelle und zuverlässige Methode, um den Serumspiegel von Anti-D zu bestimmen oder die Konzentration in einer Immunglobulinlösung zu quantifizieren.