Zeitschrift für mikrobielle und biochemische Technologie

Abstrakt

Kombination aus Reverser Transkription und Multienzym-Restriktionsfragmentlängenpolymorphismusanalyse zur schnellen Erkennung von Escherichia Coli

Akifumi Hosoda, Arata Komaba, Michiru Kishimoto und Hiroto Tamura

Zur Überwachung pathogener Mikroorganismen in Lebensmitteln werden Kultivierungsmethoden eingesetzt. Allerdings benötigen die aktuellen Methoden einige Tage, um Ergebnisse zu liefern, und Produkte werden häufig zum Verkauf freigegeben, bevor die Ergebnisse der mikrobiologischen Analyse vorliegen. Wir haben ein RNA-Extraktions- und Mikroorganismen-Erkennungssystem entwickelt, das Modelllebensmittelproben verwendet, die mit Escherichia coli K-12 und O157:H7 (GTC 14536) (0 KBE/g und 1×101–104 KBE/g) geimpft wurden. Vor der RNA-Extraktion wurden die Lebensmittelproben mit lebenden oder toten Zellen geimpft, die Proben homogenisiert und die extrahierten RNAs zur Synthese von cDNAs unter Verwendung von zufälligen 6-Mer-Molekülen verwendet. Die Zielgene wurden mittels PCR analysiert, und die PCR-Produkte wurden mit zwei Restriktionsenzymen (HhaI und HaeIII) verdaut, um den Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) zu analysieren. Die PCR bestätigte die RNA-Extraktion und cDNA-Synthese von bis zu 1×101 KBE/g Proben lebender Zellen. Multienzyme RFLP (MeRFLP) zeigte, dass die Größe der erhaltenen DNA-Fragmente mit der theoretischen Fragmentgröße übereinstimmte, was darauf schließen lässt, dass Reverse-Transkription-MeRFLP (RT-MeRFLP) die Zielbakterien identifizieren könnte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass RT-MeRFLP, das keine Kultur erfordert und innerhalb von 6,5 Stunden abgeschlossen werden kann, ein vielversprechender Ansatz für ein kostengünstiges, schnelles und zuverlässiges System zur Identifizierung von Bakterien in Lebensmitteln ist.