Zeitschrift für Pflanzenpathologie und Mikrobiologie

Abstrakt

Kolorimetrischer Immunocapture-Reverse-Transkription-Loop-vermittelter isothermer Amplifikationstest zur schnellen Erkennung des Kartoffelvirus Y

Mohammad Amin Almasi und Seyedmohammad Hosseyni Dehabadi

Der Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)-Test ist eine neuartige Technik zur Amplifikation von DNA bei konstanter Temperatur mit hoher Spezifität, Sensitivität, Schnelligkeit und Effizienz. Um den Zeitaufwand für manche diagnostischen Tests wie Reverse Transcription PCR (RT-PCR), Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) und DAS-ELISA auf ein Minimum zu reduzieren, wurde ein innovatives kolorimetrisches IC-RT-LAMP- und IC-RT-PCR-Protokoll auf Basis des Genoms des Kartoffelvirus Y (PVY) verwendet und optimiert. Zunächst wurde ein DAS-ELISA-Test durchgeführt, um das Virus in einer Sammlung mit 95 verdächtigen Proben nachzuweisen. Schließlich wurden fünf Proben als positive Proben erkannt. Anschließend wurden die positiven Proben mittels molekularer Methoden verifiziert. Dabei wurden alle vier RT-LAMP-Primer (d. h. F3, B3, FIP und BIP) zusammen mit den RT-PCR-Primern (F und B) auf Basis des Hüllprotein-Gens (CP) des PVY-Genoms ausgewählt. Obwohl DAS-ELISA-, RT-PCR- und RT-LAMP-Tests positiv infizierte Pflanzenproben erfolgreich erkennen konnten, war letzterer unter Berücksichtigung von Zeit, Sicherheit, Sensitivität, Kosten und Einfachheit insgesamt überlegen. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass der RT-LAMP-Test 100-mal sensibler und 3-mal schneller war als RT-PCR. Der LAMP-Test wurde im Wasserbad durchgeführt, entweder ohne Thermocycler-Maschine oder in hochentwickelten Laboreinrichtungen. Unter den sechs verschiedenen visuellen Farbstoffen zur genauen Erkennung von IC–RT-LAMP-Produkten konnten Hydroxynaphtholblau, GeneFinder ^TM und SYBR Green I in einem engen Röhrchenansatz lang anhaltende stabile Farbveränderungen und Helligkeiten erzeugen, um das Risiko einer Kreuzkontamination zu vermeiden, und wurden daher letztendlich als die besten empfunden. Wir schlagen diesen kolorimetrischen Test dementsprechend als äußerst zuverlässiges alternatives Viruserkennungssystem zur Erkennung von PVY und wahrscheinlich anderen virusbasierten Erkrankungen vor.