Zeitschrift für Ernährungsstörungen und Therapie

Abstrakt

Klinische Ernährung 2019: Die Auswirkungen von Kombucha-Tee auf die Darmintegrität bei Mäusen – Elaheh Mahmoudi – Alborz University of Medical Sciences

Elaheh Mahmoudi

Ziel(e): Oxidativer Stress ist an der Pathogenese von Hyperpysie beteiligt, einem Risikofaktor für kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität. Mehrere Studien an Menschen haben gezeigt, dass Tomaten-Carotinoide verschiedene Aspekte der menschlichen Gesundheit beeinflussen können. Während dieser Präsentation wird der Autor auf zwei Themen eingehen: a) Ausgleich der Reaktion von Hautzellen auf UV-Bestrahlung und b) Verringerung erhöhter Vitalfunktionen. a) Mehrere Studien an Menschen haben gezeigt, dass Tomaten-Carotinoide UV-induzierte Schäden verringern können, indem sie Erytheme reduzieren und das Gleichgewicht zwischen Kollagenproduktion und -abbau verbessern. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine Mischung aus Tomaten-Carotinoiden und Polyphenolen einen besseren Hautschutz bieten könnte als man aufgrund der Summe ihrer Aktivitäten erwarten würde. Tatsächlich haben wir verstanden, dass Mischungen aus einem Nährstoffkomplex aus Tomaten (enthält Lycopin) und Rosmarinextrakt (enthält das Polyphenol Carnosinsäure) Entzündungsmarker synergistisch reduzierten und antioxidative Aktivität in Hautzellen induzierten, was vor allem zu einer Verringerung der Matrix-Metalloproteinase (MMPs) führte und so den Kollagenabbau verringern und die Hautalterung verzögern könnte. b) Hypertonie kann ein Risikofaktor für kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität sein. Wir haben eine Dosis-Wirkungs-Analyse durchgeführt, um die optimale wirksame Dosis eines Nahrungsergänzungsmittels mit Tomatennährstoffkomplex zur Aufrechterhaltung normaler Symptome bei hypertensiven Personen zu ermitteln. Materialen und Methoden:

Zwei Gruppen von Jungtieren und Erwachsenen wurde sieben Tage lang mit Dextran-Natriumsulfat in Wasser behandelt. Zuvor wurde fKT an die an Colitis erkrankten Mäuse verabreicht und mit den altersentsprechenden normalen und unbehandelten Tieren mit Colitis verglichen.

Zubereitung von Kombucha-Tee (KT)

Schwarzer Tee (Golestan, Teheran, Iran) wurde zu kochendem Wasser (1,2 % w/v) gegeben, vermischt und 10 Minuten ziehen gelassen. Der Tee wurde dann durch ein steriles Sieb gefiltert und Saccharose (10 %) wurde im Tee aufgelöst. Um KT herzustellen, wurden 200 ml des abgekühlten Tees mit 3 % w/v Teepilz plus 10 % v/v zuvor fermentierter KT-Flüssigkeit beimpft. Die Sammlung wurde dann 14 Tage lang bei 28 °C zum Fermentieren stehen gelassen. Um gefiltertes KT (fKT) herzustellen, wurde der resultierende fermentierte Tee 20 Minuten lang bei 5000 U/min zentrifugiert und mit einem 0,45 µm Zellulosefilter gefiltert, der mit einer Luftpumpe ausgestattet war.

Experimentalgruppen und Studiendesign

Männliche NMR-Mäuse wurden vom Pasteur Institute Experimental Animal Center, Teheran, Iran, erworben. Alle Tiere wurden eine Woche lang vor Beginn der Experimente in licht- und temperaturgeregelten Räumen in der traditionellen Tierabteilung der Alborz University of Medical Sciences untergebracht. Alle Experimente wurden von der einheimischen Ethikgruppe genehmigt (Referenznummer Abzums.Rec.1395.51) und in Übereinstimmung mit dem Protokoll zur Tierpflege und -nutzung der Alborz University of Medical Sciences durchgeführt.

Die Tiere wurden in zwei Gruppen aufgeteilt, jung und alt. Jede Gruppe wurde dann weiter in zwei Gruppen (je 8) unterteilt, darunter normale und Colitis-induzierte. Wie die Abbildung zeigt, wurde jede der Colitis-induzierten alten bzw. jungen Gruppen weiter in zwei Untergruppen unterteilt, darunter Colitis-induzierte ohne Behandlung und Colitis-induzierte Colitis, die mit fKT behandelt wurde. Die Studie wurde in drei Phasen durchgeführt. Im Rahmen der Initiative wurde DSS-induzierte Colitis bei jungen (2 Monate) und alten (16 Monate) Mäusen über einen Zeitraum von 21 Tagen festgestellt. Während dieses Zeitraums wurden Gewichtsverlust und klinischer Score ausgewertet und mit altersentsprechenden gesunden Tieren verglichen. In der zweiten Phase wurden die Auswirkungen der fKT-Gabe auf die Überlebensanalyse und der klinische Score über einen Zeitraum von 21 Tagen ausgewertet. Nach Abschluss der klinischen Studie Phase I und II der Studie wurden in der klinischen Studie Phase III molekulare und histologische Bewertungen an jungen und alten gesunden Kontrolltieren, DSS-induzierter Colitis und DSS-induzierter Colitis, die mit fKT behandelt wurden, durchgeführt. Angesichts der Sterblichkeitsrate und der klinischen Symptome, die bei den Tieren mit Colitis auftraten, wurden die Tiere in dieser Phase der Studie am 14. Tag nach Beginn der Studie getötet.

Colitis-Induktion

Die Colitis wurde am Tag 0 durch Verabreichung von Trinkwasser mit 3,5 % (w/v) Dextran-Natriumsulfatsalz (DSS) (40000 kDa, MP Biomedical, Eschwege, Deutschland) pro Maus und Tag herbeigeführt. Die Tiere und die klinischen Krankheitsanzeichen wurden täglich überwacht und bis zum siebten Tag nach der Colitis-Induktion durch Gewichtsverlust, Blut im Stuhl oder um das Rektum herum und Durchfall angezeigt. Der Gewichtsverlust wurde durch Vergleich des Körpergewichts jeder Maus mit dem Basiskörpergewicht ermittelt und als Prozentsatz des Gewichtsverlusts ausgedrückt. Andere Symptome wurden entsprechend dem zuvor von Siegmund  et al . vorgeschlagenen System bewertet . Kurz gesagt, die verschiedenen Anzeichen für die Stuhlkonsistenz wurden wie folgt bewertet: Bewertung 0: wohlgeformte Pellets; Bewertung 2: breiiger und halbgeformter Stuhl, der nicht am Anus klebte; Bewertung 4: flüssiger Stuhl, der am Anus klebte. Die verschiedenen Anzeichen für Blutungen wurden wie folgt bewertet: Punktzahl 0, kein Blut gemessen mit dem Hemoccult-System (Beckman Coulter); Punktzahl 2, positives Hemoccult; Punktzahl 4, starke Blutung. Tiere mit grenzwertigen Punktzahlen erhielten die halbe Punktzahl.

Histologische und histopathologische Analyse

Um eine histologische Untersuchung des Dickdarms durchzuführen, wurden die Tiere nach der letzten Behandlung mit Getränken oder fKT unter Ethernarkose getötet. Der Dickdarm wurde zunächst mit 1x eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült, um den Kot vollständig zu entfernen. Anschließend wurden Gewebeproben des Dickdarms entnommen, in 10 % gepuffertem Formalin fixiert und für die Paraffinschnitte aufbereitet. Es wurden etwa 5 μm dicke Schnitte entnommen und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Die gefärbten Schnitte wurden mit einem Olympus cX41-Mikroskop untersucht und mit einer Olympus D330-Kamera fotografiert. Der Schadenswert lag auf einer Skala von 0 bis 4 und wurde anhand der folgenden Kriterien beurteilt: Entzündung, dargestellt durch Anzahl und Ausmaß der Leukozyteninfiltration, Epitheldefekte, dargestellt durch die Schwere der Verletzung der somatischen Zellschicht, Kryptaatrophie, visuell geschätzt durch den Prozentsatz der Atrophie innerhalb der Krypten, Ödeme, Infiltration polymorphonukleärer Zellen (PMNs) und Schleimhautstörungen.

Immunfluoreszenzstudien der ZO-1- und ZO-2-Expression

Aus jeder Probe wurden Schnitte von 5 µm dickem, in Paraffin eingebettetem Dickdarmgewebe hergestellt, entwachst, hydratisiert und in einer Proteinblocklösung inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte mit dem primären monoklonalen Kaninchen-Antikörper ZO-1 oder ZO-2 (verdünnt 1:100 in 0,01 mol/l PBS; Zo-1: ab214228, Zo-2: ab2273, Großbritannien) inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit einem Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa-Mehl 488 (ab150077, Abcam, Cambridgeshire, Großbritannien). Die Bilder wurden mit einem DeltaPix-Fluoreszenzmikroskop (Smorum, Dänemark) aufgenommen und von zwei erfahrenen Pathologen unabhängig voneinander ausgewertet.

Analyse der Genexpression mittels Echtzeit-PCR

Die Gesamt-RNA wurde aus ca. 50 mg gefrorenem Dickdarmgewebe unter Verwendung einer Guanidin/Phenol-Lösung (Reagenzlyse Qiazol-USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Standard und Menge der RNA-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines NanoDrop 2000c (Eppendorf, Deutschland) überwacht. Anschließend wurde 1 μg RNA unter Verwendung des Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (München, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers rückwärts in DNA transkribiert. Die relative Expression von mRNA für GAPDH, ZO-1 und ZO-2 wurde durch Vorbereitung eines Reaktionsmischers mit PCR Master Mix (2X) (Amplicon-Dänemark) und genspezifischen Primern mit verdünnter cDNA bestimmt und das Endvolumen mit nukleasefreiem Wasser auf 10 μl aufgefüllt. Quantifizierung und Analyse wurden in ABI-Echtzeit-PCR durchgeführt. Die von Integrated DNA Technologies entwickelten Primersequenzen waren vorwärts 5′-TGTCCCACTTGAATCCCC-3′ und rückwärts 5′-TGTTTCCTCCATTGCTGTG-3′ für ZO-1 und vorwärts 5′-CTCCCTCTTCACATCTGCTTC-3′ und rückwärts R: 5′-CTGTTACTTGCTTTGGTCTGG-3′ für ZO-2. Die Effizienz der in der Studie verwendeten Primer variierte zwischen 95 % und 105 %. Primerpaare wurden validiert, um die richtige Größe des PCR-Produkts und das Fehlen von Primerdimeren sicherzustellen. Das GAPDH-Gen wurde als interne Kontrolle gewählt, gegenüber der die mRNA-Expression des Zielgens normalisiert wurde. Der resultierende organische Phänomengrad wurde als 2-ΔCt dargestellt, wobei ΔCt die Differenz zwischen den Ct-Werten des Zielgens und von GAPDH war.

Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit Graph Pad Prism 7.01 durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. ANOVA wurde verwendet, um signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen anzuzeigen. Überlebensraten wurden mit Kaplan-Meier-Diagrammen dargestellt und mit dem Log-Rank-Test verglichen. Der P-Wert wurde als statistisch signifikant angesehen, wenn er nur 0,05 betrug.

Ergebnisse:

Merkmale und klinischer Verlauf der DSS-induzierten Kolitis

Die durch DSS induzierte Colitis bei Mäusen ist das gängige Tiermodell zur Behandlung der Pathogenese von Colitis und zur Beurteilung therapeutischer Ansätze. Dieses Modell wurde in unserem Labor entwickelt und über einen Zeitraum von 21 Tagen überwacht (Phase I). Dazu wurde männlichen NMR-Mäusen sieben Tage lang 3,5 % DSS in einem Getränk verabreicht. Während der gesamten Studie wurden die Tiere täglich auf Überlebensrate, Gewichtsverlust und klinische Anzeichen von Colitis, einschließlich Blutungen und Durchfall, untersucht und mit altersentsprechenden gesunden Tieren verglichen. Die Überlebensanalyse der jungen mit DSS behandelten Tiere zeigte, dass an Tag 7 und 14 66 % bzw. 33 % der Tiere am Leben waren und am Tag 2 alle tot waren. Im Fall der alten mit DSS behandelten Tiere ergab die Überlebensanalyse, dass an Tag 7 und 14 66 % bzw. 50 % der Tiere am Leben waren und am Tag 21 alle tot waren. In den mit DSS behandelten jungen und alten Gruppen kam es im Vergleich zu den altersentsprechenden gesunden Tieren zu einem großen Gewichtsverlust. Die mit DSS behandelten jungen Mäuse hatten an den Tagen 7 und 14 jeweils etwa 10 % und 46 % ihres Gewichts verloren. Die mit DSS behandelten alten Mäuse hatten an den Tagen 7 und 14 jeweils etwa 13,5 % und 15 % ihres Gewichts verloren. Was Anzeichen von Verdauungsstörungen betrifft, wurden bei den mit DSS behandelten jungen und alten Mäusen am 2. bzw. 3. Tag nach der DSS-Verabreichung Blutungen und Durchfall beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die mit DSS behandelten jungen Mäuse schwerwiegendere klinische Symptome und eine geringere Überlebensrate aufweisen als die mit DSS behandelten alten Mäuse.

Histologische Untersuchungen

Die histologische Analyse der mit H&E gefärbten Gewebeschnitte (Abbildung 6) aller mit DSS behandelten jungen und alten Mäuse zeigte im Vergleich zu gleichaltrigen gesunden Mäusen eine erhöhte Infiltration von PMNs, kryptischen Verlust, Epitheldefekt, Schleimhautstörung, Apoptose, Ödeme und dünnere Schleimhaut. Die Behandlung mit fKT verringerte das Ausmaß der Verletzung, obwohl das im Rahmen dieser Studie verabreichte Behandlungsschema keine vollständige Wiederherstellung des gesunden Zustands bewirkte. Bemerkenswerterweise wiesen alte, gesunde Mäuse eine stärkere Infiltration von PMNs, kryptischen Verlust und Ödeme auf als die jungen, gesunden Tiere. Wie in Abbildung 6c dargestellt, verringerte sich die Schleimhautdicke durch die Verabreichung von DSS, da der klinische Score sowohl bei jungen als auch bei alten Mäusen mit DSS-induzierter Colitis anstieg. Diese Arbeit wurde teilweise auf der 24. Internationalen Konferenz für klinische Ernährung vorgestellt ^, die  vom 4. bis 6. März 2019 in Barcelona, ​​Spanien, stattfand.