Gentechnologie

Abstrakt

Charakterisierung monomerer Proteindomänen, die spezifisch an ein hochkonserviertes 100-BP-DNA-Ziel in rRNA-Genen binden

Elodie Carnus, Marie-Véronique Demattei, Sophie Casteret, Guillaume Carpentier, Fabien Palazzoli, Solenne Bire, Christophe Bressac und Yves Bigot

Proofs of Concept haben gezeigt, dass chromosomale Gencluster, die ribosomale RNA (rRNA) kodieren, optimale Gentransfer-Integrationsorte für die Transgenexpression darstellen. Da jedoch bei Tieren DNA-Segmente effizient durch homologe Rekombination in diese Gene integriert werden können, sind neue molekulare Werkzeuge erforderlich, um Systeme zu konstruieren, die Moleküle in unmittelbarer Nähe der rRNA-Gene anvisieren können.

 Wir haben die Eigenschaften mehrerer DNA-Bindungsdomänen (DBDs) untersucht, die spezifisch ein Motiv innerhalb einer 100-bp-Region der rRNA-Gene erkennen können, die unter Eukaryoten zu 99-100 % konserviert ist. Unsere Ergebnisse zeigen, dass zwei Myb-ähnliche DBDs, die aus den von R2-nicht-LTR-Retrotransposonen kodierten Endonukleasen stammen, vielversprechende Kandidaten sind, da sie i) spezifisch und mit hoher Affinität eine 20-bp-Bindungsstelle erkennen, die sich innerhalb des erwarteten genomischen rDNA-Ziels befindet, ii) als Monomere fungieren, iii) ein Kernlokalisierungssignal enthalten, iv) funktionsfähig bleiben, wenn sie mit einer anderen Domäne fusioniert werden, und v) die Funktionalität des Proteins, mit dem sie fusioniert werden, nicht verändern. In vivo mit mehreren R2DBD-Fusionen erzielte Ergebnisse zeigen jedoch, dass zwei Eigenschaften noch verändert werden müssen, bevor diese DBDs in ein molekulares Zielsystem integriert werden können, das auf rRNA-Gene gerichtet ist. Das erste betrifft die Fähigkeit von R2DBD, sich im Nukleolus zu lokalisieren, dem Organell, in dem sich die rRNA-Gene befinden. Das zweite ist die Tendenz von R2DBD, sich in bestimmten Teilen der Kerne anzusammeln, was seine Diffusion innerhalb der Kerne einschränkt. Es werden Lösungen diskutiert, um diese derzeitigen Einschränkungen zu umgehen. Unsere Ergebnisse liefern wichtige Informationen über die Eigenschaften von R2DBD und die Zielausrichtung von Plasmid-DNA innerhalb der Kerne. Sie müssen aus drei Aspekten weiter analysiert werden: die ungenutzten Vorteile der R2DBDs, die Möglichkeiten und Grenzen von Fusionspeptiden für die Zielausrichtung von Integrationen nicht-viraler Vektoren und die Alternativen zu Fusionspeptiden für die Zielausrichtung von Vektoren.