Biochemie und analytische Biochemie

Abstrakt

Biotechnologie-Kongress 2015: Chemisch modifiziertes Cystein in Fed-Batch-Prozessen und Auswirkungen auf die CHO-spezifische Produktivität - Aline Zimmer Merck Millipore

Aline Zimmer

Die industrielle Fed-Batch-Kultivierung von Säugetierzellen wird zur Produktion von therapeutischen Proteinen wie monoklonalen Antikörpern verwendet. Neben dem Medium, das das anfängliche Wachstum sicherstellt, ist eine Fütterung erforderlich, um Wachstum, Lebensfähigkeit und Antikörperproduktion zu verbessern. Etablierte kommerzielle Systeme umfassen eine leicht saure konzentrierte Hauptzufuhr und eine separate alkalische Aminosäurezufuhr, die L-Tyrosin und L-Cystein enthält. Da L-Cystein aufgrund seiner Dimerisierung zu Cystein in Gegenwart von Luft und Metallkatalysatoren nicht stabil ist, wird ein stabiles L-Cystein-Derivat benötigt, um alle Aminosäuren in neutralen pH-Zufuhren aufzunehmen. Diese Einzelzufuhrsysteme werden bevorzugt, um Fütterungsschemata zu vereinfachen und die Gesamtprozessrobustheit durch Stabilisierung von pH- und DO-Signalen zu verbessern. Hier schlagen wir die Verwendung eines chemisch modifizierten Cysteins in Kombination mit Phosphortyrosin-Dinatriumsalz in einem industriellen Einzelzufuhr-Fed-Batch-Prozess vor, der sowohl im kleinen Maßstab als auch in Bioreaktoren anwendbar ist. Zellkulturexperimente wurden entweder in Zentrifugenröhrchen oder Bioreaktoren mit einer CHO-Suspensionszelllinie durchgeführt, die einen menschlichen monoklonalen Antikörper exprimierte. Die Dichte und Lebensfähigkeit lebender Zellen wurde mithilfe eines automatischen Zellzählgeräts gemessen. Die Medienanalyse der Überstände erfolgte für Aminosäuren nach Vorsäulenderivatisierung und UPLC-Analyse und für Vitamine mittels LC-MS/MS.

Die Metabolitenmessungen wurden mit Cedex Bio HT unter Verwendung photometrischer und turbidometrischer Methoden durchgeführt. Die Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers erfolgte mittels 2-AB-Markierung für Glykananalysen, cIEF für Ladungsvariantenanalysen und LC-MS/MS für Peptidmapping-Experimente. Stabilitätsstudien des Futters mit dem modifizierten Cystein-Derivat zeigten, dass das Molekül stabil war und dass bei Lagerung bei Raumtemperatur oder 4 °C über drei Monate hinweg kein L-Cystein oder L-Cystin freigesetzt wurde. Darüber hinaus wurde im Laufe der Zeit keine Veränderung der Farbe des Futters beobachtet. Batch-Experimente im kleinen Maßstab, bei denen L-Cystein durch die gleiche Menge chemisch modifiziertes Cystein ersetzt wurde, zeigten keine Veränderung des Wachstums- oder Lebensfähigkeitsprofils. Die Verwendung des modifizierten Cystein-Derivats in Fed-Batch-Prozessen im kleinen Maßstab zeigte eine vergleichbare maximal lebensfähige Zelldichte, verlängerte Lebensfähigkeit und erhöhte Titer im Vergleich zum etablierten System mit zwei Futtermitteln.

Bioreaktorexperimente bestätigten die im kleinen Maßstab beschriebene Steigerung der spezifischen Produktivität, wenn die Einzelzufuhrstrategie mit der Zweizufuhrstrategie verglichen wurde. Eine eingehende Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers zeigte keine Veränderung im Glykosylierungs- oder Ladungsvariantenmuster, während Peptidmapping-Experimente keine Integration der modifizierten Aminosäure in die Sequenz des monoklonalen Antikörpers feststellen konnten. Von Säugetieren gehaltene Klumpenformen für die Produktion monoklonaler Neutralisatoren (mAb) sind auf die notwendige Haltung einiger Nährstoffe wie Glukose, Nährstoffe und Aminosäuren angewiesen, um die Kulturzeit zu verlängern und die Proteinproduktion zu verbessern[1]. In realen Verfahren werden L-Cystein und L-Tyrosin aufgrund ihrer geringen Stabilität und geringen Löslichkeit bei neutralem pH-Wert unabhängig voneinander gehalten, was zu pH-Spitzen und Niederschlägen führt[2]. Um moderne Formen zu verbessern, wurden beide Aminosäuren künstlich verändert, um ihre jeweiligen Festigkeits- und Löslichkeitsprofile zu verbessern. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Phosphotyrosin-Dinatriumsalz (PTyr2Na) ein stabiler L-Tyrosin-Substituent ist und in neutralen pH-Kontrollen verwendet werden kann, ohne die Lebensstilleistung oder die mAb-Qualitätseigenschaften nachweisbar zu beeinflussen[3]. Hier präsentieren wir Ergebnisse, die unter Verwendung eines L-Cystein-Substituenten in einem neutralen pH-, Single-Feed-System erzielt wurden.

Die Zuverlässigkeit des L-Cystein-Tochterprodukts wurde in neutralem pH-Wert, CellventoTM Feed-220, über 3 Monate bei Raumtemperatur oder 4 °C getestet. Für kontrollierte Gruppenkulturen wurde ein CHO K1-Klon verwendet, der einen menschlichen mAb exprimierte. Das Wachstum wurde im Cellvento™ CHO-220-Mediensystem gemäß der Produktprozessanleitung durchgeführt. Zur Kontrolle wurden Cellvento™ Feed-220 und ein anderes primäres Cystein/Tyrosin-Feed verwendet, während im Einzelfeedverfahren das L-Cystein-Tochterprodukt und PTyr2Na direkt im neutralen pH-Wert, primären Feed, solubilisiert wurden. Die Versuche wurden in Reagenzgläsern und 1,2-l-Bioreaktoren durchgeführt. Wachstum und Zuverlässigkeit wurden mithilfe eines ViCell® überwacht, der Titer wurde mithilfe von Cedex Bio HT bestimmt und die spezifische Produktivität wurde basierend auf Titer, vitaler möglicher Zelldichte und Schwächung bestimmt.

Zur Analyse verbrauchter Medien wurde die Messung der L-Cystein-Tochter und der Aminosäuren mittels UPLC unter Verwendung des AccQ·TagTMUltra-Reagenz durchgeführt. Zur Bewertung der Reaktionsfähigkeit des Feeds wurde H2DCFDA zum neutralen pH-Wert hinzugefügt, Cellvento™ Feed-220 wurde mit dem Derivat angereichert oder nicht. Zur Bewertung der intrazellulären Reaktionsfähigkeit wurden die Zellen mit Carboxy-H2DCFDA markiert und die Fluoreszenz gemessen. Zur Bewertung der Fähigkeit der Zellen, das Derivat zu verwenden, wurden Zelllysate angereichert und die geformten Produkte mittels UPLC bewertet. Zur Analyse der mAb wurde die N-Glykosylierung nach 2-AB-Markierung mittels HPLC gemessen, während Ladungsunterschiede mittels cIEF aufgelöst wurden.

Die Untersuchung der Stabilität des L-Cystein-Substituenten in neutralem pH-Feed zeigte keine Veränderung der Substituentenkonzentration oder der L-Cystein/L-Cystin-Freisetzung, wenn er länger als 3 Monate bei Raumtemperatur oder 4 °C gelagert wurde. Es wurde keine Fällung oder Farbänderung beobachtet, was zeigt, dass der Substituent unter den getesteten Bedingungen stabil war. Das kontrollierte Gruppenwachstum in Reagenzgläsern mit dem Single-Feed-Verfahren führte zu höheren Endlebensfähigkeiten, was zu verbesserten Endtitern im Vergleich zu den Kontrollbedingungen führte. Die Ergebnisse der Reagenzgläser wurden in Bioreaktoren bestätigt, was zu höheren Endlebensfähigkeiten, erhöhten Titern und einer höheren spezifischen Produktivität mit dem Single-Feed-Verfahren führte.

Eine geringere Farboxidation wurde nach der Zugabe von H2DCFDA auf einen neutralen pH-Wert gemessen, wobei Cellvento™ Feed-220, das das Substituent enthielt, im Vergleich zu Feed allein ein geringeres rezeptives Potenzial zeigte. Eine geringere intrazelluläre Farboxidation wurde durch Zugabe von Carboxy-H2DCFDA zu in Röhrchen mit Einzelzufuhr gehaltenen Clusterkulturen festgestellt, die bei Verwendung des Substituenten ein geringeres intrazelluläres rezeptives Speziesalter zeigten. Beim Zugeben in Zelllysate wurde das Cystein-Substituent an Cystein gebunden. Im abgegebenen mAb wurde kein Unterschied in der N-Glykosylierung oder Ladungsvariation festgestellt, was zeigt, dass das Substituent keinen Einfluss auf die abgegebenen grundlegenden Qualitätseigenschaften hat. Diese Analyse zeigt, dass das L-Cystein-Substituent und PTyr2Na in eine neutrale pH-Kontrolle integriert und als Quelle für L-Cystein in konzentrierten Clusterformen verwendet werden können, was zu einer höheren spezifischen Effizienz im Vergleich zum besten Verfahren führt, ohne die grundlegenden Qualitätseigenschaften des mAb zu beeinflussen.