Zeitschrift für Pflanzenpathologie und Mikrobiologie

Abstrakt

Eine einfache und effiziente Methode zur Extraktion von S. Rolfsii- DNA für PCR-basierte Diversitätsstudien

Männlicher AS, Kato F und Mukankusi CM

Bei den derzeitigen Verfahren zur Extraktion von DNA aus Sclerotium rolfsii werden viele gefährliche organische Chemikalien verwendet, um qualitativ hochwertige DNA zu extrahieren. Die Extraktion der DNA wird zusätzlich durch Exopolysaccharide erschwert, die sich an die DNA binden und sie schleimig machen. Wir haben ein einfaches und effizientes Protokoll zur Extraktion hochwertiger DNA aus S. rolfsii entwickelt. Unser Verfahren verwendet einen DNA-Extraktionspuffer, der Natriumdodecylsulfat und Proteinase K zur Inaktivierung von Proteinen sowie eine hohe Salzkonzentration zur Ausfällung der Exopolysaccharide enthält. Während des DNA-Extraktionsprozesses werden weder Phenol, Chloroform noch Isoamylalkohol verwendet. Außerdem ist keine Gefriertrocknung des Myzels und kein Mahlen in flüssigem Stickstoff erforderlich. Mit unserem Verfahren wurde aus 100 mg Myzel eine ausreichende Menge reiner (mittlerer A260: A280 = 1,91 ± 0,001) DNA (Mittelwert = 55,57 ± 0,002 ng/µl) gewonnen. Die DNA ließ sich mit Hilfe von Inter-Simple Sequence Repeat-Primern und Primern, die auf die interne transkribierte Spacer-Region von S. rolfsii abzielen, mittels PCR amplifizieren. Unsere Methode wird in Laboren, die keinen Zugang zu flüssigem Stickstoff und Gefriertrocknungsanlagen haben, sehr nützlich sein und als Katalysator für PCR-basierte phylogenetische Studien dieses wichtigen Krankheitserregers der Gartenbohne dienen.